第十四期/2025年6月 微生物病原體庫與Cytek光譜流式細胞儀
成大醫院臨床醫學研究中心電子報
第十四期 2025.6.
研究服務公告 - 微生物病原體庫
主題介紹 - Cytek光譜流式細胞儀
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微生物病原體庫
微生物病原體庫實驗室位於住院大樓2樓病理部病毒組，本核心實驗室具備國際標準之環境設備，設有「BSL-2生物安全第二等級負壓實驗室」。實驗室裝設Class II AII及Class II BII (100%外排氣)生物安全櫃、CO2培養箱、離心機、自動化核酸檢測機台與即時聚合酶反應溫控循環儀等重要儀器，供操作病毒培養與鑑定、病毒抗原和病毒核酸等代檢服務，以嘉惠成大醫院及院外醫療院所與研究單位。
本實驗室依循生物安全及生物保全相關規範保存病原體材料，並通過疾病管制署之查核標準。每年分離之數千株病毒株，均以-80℃冷凍保存，並詳加分類記錄建檔，以確保實驗室得以最快速並有系統的方式，將病原體材料提供臨床或研究發展使用。臨床或研究相關單位可利用本實驗室保存之病原體材料進行病毒的抗藥性分析、病毒基因分型、病毒量測定與產品驗證等相關研究。
本核心實驗室的一大特色，在於運用real-time PCR或免疫螢光染色等技術，針對「流行性感冒病毒」（Influenza virus）、「腸病毒」（Enterovirus）及「登革病毒」 (Dengue virus)等，進行病毒亞型或基因型分析，對病毒流行病學研究提供極大助益。本核心實驗室秉持服務精神，將持續從事更完善與高品質的病原體檢測與保存之服務。
服務注意事項：
申請病毒株分讓前，請務必檢附申請單位之生物安全會同意證明與研究計畫摘要；申請冷凍剩餘檢體分讓前，請務必檢附申請單位之生物安全會同意證明、研究計畫摘要與人體試驗委員會(IRB)通過證明，並須取得成大醫院病理部剩餘檢體取用申請之同意。
聯絡資訊:
顧問研究員：王貞仁 教授 (分機：5786) E-mail: jrwang@mail.ncku.edu.tw
技術員：蔡慧頻組長E-mail: tsaihp@mail.ncku.edu.tw /病毒組全體醫檢師與研究助理
位址：住院大樓2樓 病理部 病毒室(分機：2653, 2616)
更多詳細資訊請參考臨醫中心核心實驗室網頁 (臨醫中心→核心實驗室→微生物病原體庫)。
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Cytek光譜流式細胞儀
產品資訊提供：禾豐醫企業產品經理 林宗成
本期電子報特別介紹研究之重要利器Cytek光譜流式細胞儀。目前於成大醫學院有建置Cytek Northern Light，已擴充至該機型最大之三雷射，可偵測螢光數大於30。本中心擬於明年度購置具有同等效能且更具擴充性之新機型。屆時請各位先進、同仁多多參考利用。
~前言~
流式細胞儀(Flow Cytometry)技術自1970 年代發展至今，在免疫學、癌症生物學等細胞分析領域中是不可或缺的重要工具。透過快速偵測細胞的多種特性，例如表面抗原表達、細胞內之蛋白表現、DNA的含量、偵測離子通透或膜電位變化等等，進一步定義不同細胞族群分布(Immune profiling)及其功能。
流式細胞儀的經典光學設計架構，主要是利用不同波長的光學反射鏡(Optical Mirrors)與帶通濾片(Bandpass Filters)，將待測細胞顆粒上之不同波長的螢光分子所散射之螢光訊號分別引導至個別的光學偵測器內，藉此區分不同波段之螢光物質。然而，由於濾片式的光路設計無法有效區隔散射波長相近的螢光分子，且受到預設之濾片規格限制，因此使用者只能接受特定之螢光種類及組合，造成可同時使用的螢光數目與種類受到一定的限制；此外，為了避免相近的散射波長之螢光分子訊號互相干擾，帶通濾片可偵測的波段會侷限在特定範圍內，導致無法將整體之散射螢光訊號進行收集，進而犧牲光學偵測的靈敏度。為突破傳統濾片式分光技術的瓶頸，Cytek開發了創新的全光譜式偵測技術（Full Spectrum ProfilingTM, FSPTM），提供更高的解析能力與更靈活的螢光選擇，為細胞分析開啟全新視野。
~全光譜分析系統技術 (FSP™)~
Cytek利用專利之多通道粗波復用(CWDM)技術，將不同波長之螢光訊號展開以達成全光譜偵測的目標。此技術目前多應用於光纖通訊領域，將多種複雜的訊號整合為單一訊號便於傳輸，爾後利用解波器將整合後的訊號再次拆解。
本儀器搭載3支雷射，分別激發欲偵測之螢光物質後，透過各自雷射後方的高靈敏度之雪崩光電二極體全陣列偵測模組(APD arrays)收取，再由專利設計之特殊解波器拆分出各個波段之螢光訊號，最後藉由軟體將三個偵測模組之光譜訊號組合成該螢光物質的特殊光譜署名(Spectral Signature)(圖一)。
圖一、Cytek Northern Lights 3雷射系統所偵測呈現出來的特殊光譜署名(Spectral Signature)
在建構出各自螢光的特殊光譜署名後，再運用軟體使用即時光譜拆解(spectral unmixing)技術，將樣本中的混合型光譜進行分析，透過Ordinary Least Squares (OLS)最小二乘機的數學運算來分析混合型光譜中各種螢光所貢獻的比例。此運算準確度的關鍵因子為每種特殊光譜署名(Spectral Signature)的差異程度，因此提供各個正確的光譜署名將能夠讓軟體正確且快速地將樣本中混合光譜訊號逐一拆解並計算各個螢光訊號強度的占比，最終提供該螢光代表的標記表現量。
~Cytek全光譜流式細胞儀的使用優勢~
由於該技術有別於傳統流式細胞儀僅單獨分析濾片偵測的單一波段訊號，全光譜流式細胞儀利用整體光譜署名來進行全盤的分析。其最大的差異與優勢在於：
1. 可突破傳統流式細胞儀在螢光組合上的限制：透過有效區分波長相近但光譜特徵(Spectrum Signature)不同之螢光分子，可同時偵測更多訊號。例如APC與Alexa 647，兩種螢光物質的散射波長在傳統的流式細胞儀上共用同一個偵測器(圖二左上)，因此無法同時使用。透過Cytek全光譜分析兩種螢光物質的光譜特徵(圖二左下)，使其可以在同一個檢體同時進行分析(圖三右)。
圖二、<左上> APC與Alexa647在傳統濾片式流式細胞儀因散射波段很近，因此僅能使用同一個濾片分光，無法在同一次實驗內使用。<左下>APC與Alexa647在Cytek Aurora光譜式流式細胞儀所呈現的光譜署名差異很大，因此可以在同一次實驗內使用。<右>利用APC與Alexa647的抗體進行偵測不同群的細胞，可以看到的確能夠顯著的分群，代表可以在同一次實驗內使用。
2. 有效降低自體螢光干擾：在傳統濾片式的機器上僅能被動的接受自體螢光的訊號干擾，導致配色或後續分析都受到很大阻礙。本儀器可針對樣本本身之背景自體螢光進行偵測，套用自體螢光扣除(Autofluorescence extraction)功能，降低背景值干擾並大幅提升解析度(圖三)。
圖三、將帶有mCherry的載體轉染進HeLa細胞後進行偵測，可以發現利用自體螢光扣除功能，可將實際有表達mCherry的細胞與未表達的細胞區分開來。
3. 可大幅提升實驗效率：由於可同時偵測多種螢光參數，能大幅縮減實驗耗材與抗體用量，並且減少批次誤差(Batch errors)。目前在5雷射的Cytek儀器規格中，已經實現單管樣本進行40色以上的高階分析實驗應用；在3雷射的規格也可以實現31色的高參數分析應用。
4. 可重複使用Reference Control：在傳統濾片式的儀器中，由於使用PMT(光電倍增管)進行光電轉換，其穩定度與紅光區段的靈敏度不佳，因此每次進行實驗時，都需額外準備單染組樣本，對於珍貴且量少的臨床檢體分析相當具有挑戰性。而Cytek 儀器所搭載利用APD array的偵測器陣列，透過其高效率的光電訊號轉換以及低雜訊、高線性的特性並搭配每日進行QC (quality control)的步驟來微調APD的偵測數值，藉此讓儀器的偵測效能維持一致性，實現重複使用Reference Control的需求，大幅節省珍貴樣本的浪費與染色試劑的花費。
~總結~
由於全光譜流式細胞儀能夠單管偵測多種顏色以及去除組織自體螢光的干擾，因此能夠大大彌補傳統流式細胞儀在實驗設計與後續分析上的諸多限制，其儀器內含的全光譜分析技術與軟體運算效能都是因應現今大數據與高參數分析需求相當重要的新穎技術，透過可分析多種細胞之表面抗原與自體螢光去除的功能，讓許多不同組織內的immune profile分析更加快速且精準，再搭配降維的演算法，將大量的資料進行視覺化的處理，藉此幫助高參數細胞數據的解讀與分析。截至目前為止，已有多達1600多篇文獻使用Cytek的光譜分析技術來進行實驗，其中不乏高影響因子的期刊，相信全光譜的分析技術將能夠幫助研究者發現更多以往所無法看到的細節，也期許能夠幫助研究者提升研究量能與探索未知的能力。
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【論文獎勵公告】依據113年10月17日成附醫臨醫字第1131500015號函公告，自2025年1月1日起調整部分期刊論文獎勵發放金額如下：(1) 第一類期刊(MDPI、Frontiers Media、Baishideng Publishing Group、OMICS Publishing Group)分為兩階段：2025年1月1日起投稿之論文，獎勵金*30%；2025年7月1日起投稿之論文則停發獎勵金；(2) 2025年1月1日起投稿在「類別二加強實質審查期刊名單」則由獎金*50%修訂為獎勵金*30%，並將BMC系列期刊列入此類。
【院內計畫公告】依據114年1月9日成附醫臨醫字第1141500002號函公告，113年院內計畫主持人應於114年3月31日前將研究計畫結案報告上傳至院內研究計畫線上申請系統。未依規定時間內繳交報告者，停止其申請下年度院內研究計畫之資格。
【演講公告】114/3/21(五)12:30-14:00，邀請台北醫學大學吳麥斯校長演講，講題為Streamlined Clinical Trials: Trends and Key Success，演講地點為醫學院1樓第一講堂。
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近期儀器訓練課程:
近期儀器訓練課程:
6月 11日 自動化活細胞影像系統暨多功能光學檢測儀(Cell discoverer)
6月 11日 全內反射螢光顯微影像系統
6月12日 HIVE高速科研數據處理系統
6月12日 倒立與水平對射式雙收光片層光顯微鏡
6月27日 高通量螢光顯微藥物開發系統(C-HTS)
6月27日 高解析度活細胞螢光影像系統(Delta-Vision)
6月27日 超高解析度光學影像系統(Super-Resolution)
6月26日 全景組織體細胞定量分析儀(TissueFaxs)
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分享近期同仁發表之優秀論文，請參閱臨醫中心論文發表榮譽榜
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【院外計畫】國科會114年度第2期產學合作研究計畫，申請日期自即日起至民國114年6月27日(五)上午9:00前完成線上申請作業。
【院外計畫】中研院生醫所徵求CRC研究計畫，申請日期自即日起至民國114年8月1日(四)完成計劃書繳交。
【國科會獎項申請】2025台灣創新技術博覽會－未來科技館辦理之未來科技獎徵件，申請日期自即日起至民國114年6月30日(一)23:59前完成線上報名。
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敬請同仁於使用臨醫中心資源並發表論文時，於論文致謝欄（Acknowledgement）加註致謝臨醫中心並通知儀器管理員。致謝文句請參考以下範例：We thank the staff of Clinical Medicine Research Center, National Cheng Kung University Hospital for the technical support.
